Alors que des soldats d'élite transportent une arme révolutionnaire mise au point par la société M.A.R.S (Military Armaments Research Syndicate), leur convoi est attaqué par une force militaire inconnue menée par la Baronne (Sienna Miller) et Storm Shadow (Lee Byung-hun). Grâce à l'intervention d'une unité de G.I. Joe, les soldats terroristes doivent s'enfuir sans pouvoir mettre la main sur l'arme. Du convoi de soldats, il ne reste que Ripcord (Marlon Wayans) et Duke (Channing Tatum).

Ripcord et Duke sont amenés, avec l'arme, à la base des G.I. Joe dirigé par le général Hawk (Dennis Quaid). Ils y subissent un entraînement poussé qui en fera des super soldats, des G.I. Joe.

Plus tard, la base est attaquée par la même force militaire inconnue, laquelle s'emparera cette fois-ci de l'arme révolutionnaire, des ogiveschargées de nanorobots destructeurs.

Cependant, les G.I. Joe déterminent que les ogives seront activées à Paris. Ils s'y rendent pour mettre fin à la menace terroriste qui plane sur la ville. Ils y parviendront, mais Duke sera fait prisonnier.

Duke est amené à la base sous-marine secrète de la société M.A.R.S, dirigée par McCullen (Christopher Eccleston). Grâce à Duke, les G.I. Joe découvriront où elle est située et lanceront toutes leurs forces pour contrer la menace terroriste.

Ils y parviendront, mais un groupe terroriste naîtra des cendres : C.O.B.R.A.